Gigapikselowy mikroskop biurkowy: 10 kroków (ze zdjęciami)

2024 Autor: John Day | [email protected]. Ostatnio zmodyfikowany: 2024-01-30 11:30

W mikroskopach optycznych istnieje fundamentalny kompromis między polem widzenia a rozdzielczością: im drobniejszy szczegół, tym mniejszy obszar obrazowany przez mikroskop. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tego ograniczenia jest przełożenie próbki i uzyskanie obrazów w większym polu widzenia. Podstawową ideą jest połączenie wielu obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu utworzenia dużego pola widzenia. Na tych obrazach można zobaczyć zarówno pełną próbkę, jak i drobne szczegóły w dowolnej części próbki. Rezultatem jest obraz składający się z około miliarda pikseli, znacznie większy w porównaniu do zdjęć zrobionych lustrzanką cyfrową lub smartfonem, które zazwyczaj mają około 10 do 50 milionów pikseli. Obejrzyj te gigapikselowe krajobrazy, aby uzyskać imponującą demonstrację ogromnej ilości informacji na tych zdjęciach.

W tej instrukcji omówię, jak zbudować mikroskop zdolny do obrazowania pola widzenia 90 mm x 60 mm z pikselami odpowiadającymi 2 μm na próbce (chociaż myślę, że rozdzielczość jest prawdopodobnie bliższa 15 μm). System wykorzystuje obiektywy aparatu, ale tę samą koncepcję można zastosować przy użyciu obiektywów mikroskopu, aby uzyskać jeszcze lepszą rozdzielczość.

Przesłałem gigapikselowe obrazy, które uzyskałem za pomocą mikroskopu na EasyZoom:

Obraz magazynu National Geographic z 1970 r.

Obrus na szydełku zrobiła moja żona

Różna elektronika

Inne zasoby:

Samouczki z mikroskopii optycznej:

Rozdzielczość optyczna:

Oprócz łączenia obrazów, ostatnie postępy w obrazowaniu obliczeniowym umożliwiają mikroskopię gigapikselową nawet bez przesuwania próbki!

Krok 1: Lista dostaw

Materiały:

1. Lustrzanka cyfrowa Nikon (użyłem mojego Nikona D5000)

2. Obiektyw o ogniskowej 28 mm z gwintem 52 mm

3. Obiektyw o ogniskowej 80 mm z gwintem 58 mm

4. Łącznik odwrotny 52 mm do 58 mm

5. Statyw

6. Siedem arkuszy sklejki o grubości 3 mm

7. Arduino Nano

8. Dwa mostki H L9110

9. Dwa emitery IR

10. Dwa odbiorniki podczerwieni

11. Przycisk

12. Dwa rezystory 2,2 kOhm

13. Dwa rezystory 150Ohm

14. Jeden rezystor 1kOhm

15. Zdalne wyzwalanie aparatu Nikon

16. Czarna tablica plakatowa

17. Zestaw sprzętu:

18. Dwa silniki krokowe (użyłem dwubiegunowego silnika krokowego Nema 17 3.5V 1A)

19. Dwie śruby pociągowe 2 mm

20. Cztery bloki poduszek

21. Dwie nakrętki śruby pociągowej

22. Dwie tuleje ślizgowe łożyska i wały liniowe 200mm:

23. Zasilanie 5V:

24. Drut do owijania drutu

Narzędzia:

1. Wycinarka laserowa

2. Drukarka 3D

3. Klucze imbusowe

4. Przecinaki do drutu

5. Narzędzie do owijania drutu

Krok 2: Przegląd systemu

Aby przesunąć próbkę, dwa silniki krokowe ustawione w prostopadłych kierunkach przesuwają stolik w kierunku x i y. Silniki sterowane są za pomocą dwóch mostków H i Arduino. Czujnik podczerwieni umieszczony u podstawy silnika krokowego służy do zerowania stopni, aby nie wpadały na żaden z końców bloków. Nad stolikiem XY znajduje się mikroskop cyfrowy.

Po ustawieniu próbki i wyśrodkowaniu stolika należy nacisnąć przycisk, aby rozpocząć akwizycję. Silniki przesuwają scenę w lewy dolny róg i wyzwalana jest kamera. Silniki następnie przesuwają próbkę małymi krokami, ponieważ aparat robi zdjęcie w każdej pozycji.

Po wykonaniu wszystkich zdjęć obrazy są następnie łączone w celu utworzenia gigapikselowego obrazu.

Krok 3: Montaż mikroskopu

Zrobiłem mikroskop o małym powiększeniu z lustrzanką cyfrową (Nikon 5000), obiektywem Nikon 28mm f/2.8 i obiektywem zmiennoogniskowym Nikon 28-80mm. Obiektyw zmiennoogniskowy został ustawiony na ogniskową równą 80mm. Zestaw dwóch soczewek działa jak soczewka tubusu mikroskopu i soczewka obiektywu. Całkowite powiększenie to stosunek ogniskowych, około 3X. Soczewki te naprawdę nie są przeznaczone do tej konfiguracji, więc aby światło rozchodziło się jak pod mikroskopem, musisz umieścić przysłonę między dwoma soczewkami.

Najpierw zamontuj w aparacie obiektyw o dłuższej ogniskowej. Z czarnej tablicy plakatowej wytnij okrąg o średnicy mniej więcej wielkości przedniej powierzchni obiektywu. Następnie wyciąć małe kółko w środku (ja wybrałem około 3mm średnicy). Rozmiar koła określi ilość światła wpadającego do systemu, zwaną również aperturą numeryczną (NA). NA określa rozdzielczość poprzeczną systemu dla dobrze zaprojektowanych mikroskopów. Dlaczego więc nie użyć wysokiej NA do tej konfiguracji? Cóż, są dwa główne powody. Po pierwsze, wraz ze wzrostem NA, aberracje optyczne systemu stają się bardziej widoczne i ograniczają rozdzielczość systemu. W niekonwencjonalnej konfiguracji, takiej jak ta, prawdopodobnie tak będzie, więc zwiększenie NA w końcu nie pomoże już poprawić rozdzielczości. Po drugie, głębia ostrości również zależy od NA. Im wyższa NA, tym płytsza głębia ostrości. Utrudnia to wyostrzenie obiektów, które nie są płaskie. Jeśli NA stanie się zbyt wysokie, ograniczysz się do obrazowania szkiełek mikroskopowych, które zawierają cienkie próbki.

Umieszczenie przysłony między dwoma obiektywami sprawia, że system jest z grubsza telecentryczny. Oznacza to, że powiększenie systemu jest niezależne od odległości obiektu. Staje się to ważne przy łączeniu obrazów. Jeśli obiekt ma różną głębokość, widok z dwóch różnych pozycji będzie miał przesuniętą perspektywę (jak ludzkie widzenie). Łączenie ze sobą obrazów, które nie pochodzą z telecentrycznego systemu obrazowania, jest wyzwaniem, zwłaszcza przy tak dużym powiększeniu.

Użyj sprzęgacza odwrotnego obiektywu 58 mm do 52 mm, aby przymocować obiektyw 28 mm do obiektywu 80 mm z przysłoną umieszczoną pośrodku.

Krok 4: Scenografia XY

Zaprojektowałem scenę za pomocą Fusion 360. Dla każdego kierunku skanowania są cztery części, które należy wydrukować w 3D: mocowanie montażowe, dwa przedłużacze prowadnic i mocowanie śrubą pociągową. Podstawa i podesty sceny XY są wycinane laserowo ze sklejki o grubości 3mm. Podstawa zawiera silnik i suwaki w kierunku X, platforma X zawiera silnik i suwaki w kierunku Y, a platforma Y zawiera próbkę. Podstawa składa się z 3 arkuszy, a dwie platformy składają się z 2 arkuszy. W tym kroku dostarczane są pliki do cięcia laserowego i drukowania 3D. Po wycięciu i wydrukowaniu tych części jesteś gotowy na kolejne kroki.

Krok 5: Montaż do silnika

Za pomocą narzędzia do owijania drutu owinąć drut wokół przewodów dwóch nadajników IR i dwóch odbiorników IR. Oznacz kolorami przewody, aby wiedzieć, który koniec jest który. Następnie odetnij przewody od diod, aby od tego momentu biegły tylko przewody do owijania drutu. Przesuń przewody przez prowadnice w uchwycie silnika, a następnie wepchnij diody na miejsce. Przewody są skierowane tak, że nie są widoczne, dopóki nie wyjdą z tyłu urządzenia. Przewody te można łączyć z przewodami silnika. Teraz zamontuj silnik krokowy za pomocą czterech śrub M3. Powtórz ten krok dla drugiego silnika.

Krok 6: Montaż sceny

Sklej ze sobą nacięcia podstawy 1 i podstawy 2, jedno z nich z sześciokątnymi otworami na nakrętki M3. Gdy klej wyschnie, wbij nakrętki M3 na miejsce. Nakrętki nie będą się obracać po wciśnięciu w deskę, więc później będziesz mógł wkręcić śruby. Teraz przyklej trzeci arkusz bazowy (baza 3), aby zakryć nakrętki.

Teraz nadszedł czas na montaż mocowania nakrętki prowadzącej. Usuń wszelkie dodatkowe włókno z uchwytu, a następnie wciśnij cztery nakrętki M3 na miejsce. Są ciasno dopasowane, więc upewnij się, że usuniesz miejsce na śrubę i nakrętkę za pomocą małego śrubokręta. Po wyrównaniu nakrętek wciśnij nakrętkę prowadzącą do mocowania i przymocuj ją 4 śrubami M3.

Zamocuj poduszki, mocowania suwaków i mocowanie silnika dla liniowego translatora w kierunku X do podstawy. Umieść zespół nakrętki prowadzącej na śrubie pociągowej, a następnie wsuń śrubę pociągową na miejsce. Użyj łącznika, aby podłączyć silnik do śruby pociągowej. Umieść suwaki w prętach, a następnie wepchnij pręty w mocowania suwaka. Na koniec przymocuj przedłużacze do montażu suwaka za pomocą śrub M3.

Arkusze sklejki X1 i X2 są sklejane w podobny sposób jak podstawa. Ta sama procedura jest powtarzana dla translatora liniowego w kierunku Y i etapu próbkowania.

Krok 7: Elektronika skanera

Każdy silnik krokowy ma cztery kable, które są podłączone do modułu mostka H. Cztery kable z nadajnika i odbiornika IR są podłączone do rezystorów zgodnie z powyższym schematem. Wyjścia odbiorników są podłączone do wejść analogowych A0 i A1. Dwa moduły mostka H są podłączone do pinu 4-11 w Arduino Nano. Przycisk jest podłączony do pinu 2 z rezystorem 1kOhm dla prostego wprowadzania danych przez użytkownika.

Wreszcie przycisk wyzwalający lustrzankę cyfrową jest podłączony do zdalnej migawki, tak jak zrobiłem to w przypadku mojego skanera CT (patrz krok 7). Odetnij kabel zdalnej migawki. Przewody są oznakowane w następujący sposób:

Żółty – skupienie

Czerwony – migawka

Biały – mielony

W celu skupienia strzału żółty przewód musi być podłączony do masy. Aby zrobić zdjęcie, zarówno żółty, jak i czerwony przewód muszą być podłączone do masy. Podłączyłem diodę i czerwony kabel do pinu 12, a następnie podłączyłem inną diodę i żółty kabel do pinu 13. Konfiguracja jest zgodna z opisem w instrukcji DIY Hacks and How-Tos.

Krok 8: Pozyskiwanie obrazów gigapikselowych

W załączeniu kod do mikroskopu gigapikselowego. Do sterowania silnikami za pomocą mostka H wykorzystałem bibliotekę Stepper. Na początku kodu musisz określić pole widzenia mikroskopu oraz liczbę obrazów, które chcesz uzyskać w każdym kierunku.

Na przykład zrobiony przeze mnie mikroskop miał pole widzenia około 8,2 mm x 5,5 mm. Dlatego poleciłem silnikom przesunięcie 8 mm w kierunku x i 5 mm w kierunku y. W każdym kierunku uzyskuje się 11 obrazów, w sumie 121 obrazów dla pełnego obrazu gigapikselowego (więcej szczegółów na ten temat w kroku 11). Następnie kod oblicza liczbę kroków, które muszą wykonać silniki, aby przesunąć scenę o tę wartość.

Skąd etapy wiedzą, gdzie są w stosunku do silnika? Jak przebiegają etapy bez uderzania w żaden z końców? W kodzie konfiguracji napisałem funkcję, która przesuwa scenę w każdym kierunku, aż przełamie ścieżkę między emiterem IR a odbiornikiem IR. Gdy sygnał na odbiorniku IR spadnie poniżej pewnego progu, silnik zatrzymuje się. Następnie kod śledzi pozycję sceny w stosunku do tej pozycji wyjściowej. Kod jest napisany tak, aby silnik nie przesuwał się zbyt daleko, co spowodowałoby, że scena wjechałaby na drugi koniec śruby pociągowej.

Po skalibrowaniu stolika w każdym kierunku, stolik jest przesuwany do środka. Używając statywu, ustawiłem mikroskop dSLR nad sceną. Ważne jest, aby wyrównać pole kamery z przecinającymi się liniami na stoliku z próbką. Gdy scena zrównała się z kamerą, przykleiłem scenę taśmą malarską, a następnie umieściłem próbkę na scenie. Ostrość regulowano za pomocą kierunku Z statywu. Użytkownik następnie naciska przycisk, aby rozpocząć akwizycję. Scena przesuwa się w lewy dolny róg i uruchamiana jest kamera. Następnie scena rastrowa skanuje próbkę, a aparat robi zdjęcie w każdej pozycji.

Dołączony jest również kod do rozwiązywania problemów z silnikami i czujnikami podczerwieni.

Krok 9: Łączenie obrazów

Mając wszystkie nabyte obrazy, stoisz teraz przed wyzwaniem zszycia ich wszystkich razem. Jednym ze sposobów obsługi łączenia obrazów jest ręczne wyrównywanie wszystkich obrazów w programie graficznym (użyłem Autodesk Graphics). To na pewno zadziała, ale może to być bolesny proces, a krawędzie obrazów są zauważalne na obrazach gigapikselowych.

Inną opcją jest użycie technik przetwarzania obrazu do automatycznego łączenia obrazów. Chodzi o to, aby znaleźć podobne funkcje w nakładających się częściach sąsiednich obrazów, a następnie zastosować transformację translacji do obrazu, aby obrazy były wyrównane do siebie. Na koniec krawędzie można łączyć ze sobą, mnożąc nakładającą się sekcję przez liniowy współczynnik wagi i dodając je do siebie. Może to być zniechęcający algorytm do pisania, jeśli dopiero zaczynasz przetwarzać obrazy. Przez chwilę pracowałem nad tym problemem, ale nie mogłem uzyskać w pełni wiarygodnego wyniku. Algorytm zmagał się najbardziej z próbkami, które miały bardzo podobne cechy w całym tekście, takie jak kropki na obrazie magazynu. W załączniku znajduje się kod, który napisałem w Matlab, ale wymaga trochę pracy.

Ostatnią opcją jest użycie gigapikselowych programów do łączenia fotografii. Nie mam nic do zasugerowania, ale wiem, że tam są.

Krok 10: Wydajność mikroskopu

Na wypadek, gdybyście go przegapili, oto wyniki: zdjęcie z czasopisma, szydełkowy obrus i różnorodna elektronika.

Specyfikacje systemu są wymienione w powyższej tabeli. Próbowałem obrazowania za pomocą obiektywu o ogniskowej 28 mm i 50 mm. Oszacowałem najlepszą możliwą rozdzielczość systemu na podstawie granicy dyfrakcji (ok. 6μm). W rzeczywistości trudno jest przetestować to eksperymentalnie bez celu o wysokiej rozdzielczości. Próbowałem wydrukować plik wektorowy wymieniony na tym forum fotografii wielkoformatowej, ale byłem ograniczony rozdzielczością mojej drukarki. Najlepsze, co udało mi się ustalić z tym wydrukiem, to to, że system miał rozdzielczość <40μm. Szukałem również małych, izolowanych cech na próbkach. Najmniejszą cechą na wydruku z magazynu jest plama atramentu, którą oszacowałem na około 40 μm, więc nie mogłem jej użyć do lepszego oszacowania rozdzielczości. W elektronice pojawiły się małe wgłębienia, które były całkiem dobrze odizolowane. Ponieważ znałem pole widzenia, mogłem policzyć liczbę pikseli zajmujących małą działkę, aby uzyskać szacunkową rozdzielczość, około 10-15 μm.

Ogólnie jestem zadowolony z wydajności systemu, ale mam kilka uwag na wypadek, gdybyś chciał wypróbować ten projekt.

Stabilność sceny: Po pierwsze, zdobądź wysokiej jakości komponenty liniowe. Komponenty, których użyłem, miały o wiele więcej luzu, niż się spodziewałem. Do każdej wędki użyłem tylko jednego z mocowań suwakowych w zestawie, więc może dlatego scena nie wydawała się zbyt stabilna. Scena działała dla mnie wystarczająco dobrze, ale byłoby to większym problemem w przypadku systemów o większym powiększeniu.

Optyka dla wyższej rozdzielczości: ten sam pomysł można zastosować w przypadku mikroskopów o większym powiększeniu. Wymagane będą jednak mniejsze silniki z mniejszymi krokami. Na przykład powiększenie 20X z tą lustrzanką cyfrową dałoby pole widzenia 1 mm (jeśli mikroskop może zobrazować tak duży system bez winietowania). Electronupdate wykorzystał silniki krokowe z odtwarzacza CD w ładnej konstrukcji dla mikroskopu o większym powiększeniu. Kolejnym kompromisem będzie płytka głębia ostrości, co oznacza, że obrazowanie będzie ograniczone do cienkich próbek i będziesz potrzebować dokładniejszego mechanizmu translacji w kierunku Z.

Stabilność statywu: Ten system działałby lepiej z bardziej stabilnym mocowaniem aparatu. System soczewek jest ciężki, a statyw jest pochylony o 90 stopni od pozycji, do której został zaprojektowany. Musiałem przykleić taśmą stopy statywu, aby zapewnić stabilność. Migawka mogła również potrząsnąć aparatem na tyle, aby rozmyć obrazy.